非還原SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5*Non-Reducing SDS-PAGE Sample Loading Buffer)是一種經過改良的以溴酚藍為染料，5倍濃縮的蛋白上樣緩沖液。本產品含SDS等變性試劑，不含DTT、巰基乙醇等還原性試劑，可以用于常規的SDS-PAGE 蛋白樣品的上樣。
1、在室溫或不超過 37℃的水浴中溶解蛋白上樣緩沖液(5X)，水浴溶解后立即室溫存放，盡量避免長時間 置于水浴中。
2、按照每4ul 蛋白樣品加入1ul 蛋白上樣緩沖液(5X)的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液 (5X)。
3、100℃金屬浴或沸水浴加熱 5-10 分鐘，以充分變性蛋白。
4、冷卻到室溫后，直接上樣到 SDS-PAGE 膠加樣孔內即可。
5、通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
1、蛋白上樣緩沖液(5X)必須完全溶解后再使用。
2、本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。
3、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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答：如果能夠排除下面的幾個問題，那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
1、二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
2、ECL底物中H2O2不穩定，失活；
3、ECL底物沒覆蓋到相應位置；
4、一抗選擇不當；
5、二抗失活。
答：可能的原因有：
1、膜沒有完全均勻濕透,建議 使用100% methanol浸透膜；
2、洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數；
3、電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調整電極和加樣；
4、封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜；
5、封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；
6、封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜；
7、抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間；
8、一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度；
9、一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結合過夜；
10、抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間；
11、化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物。
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