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DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。當與細胞膜結(jié)合后其熒光強度大大增強，這類染料有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。一旦對細胞染色，這類染料在整個細胞膜上擴散，佳濃度時可以使整個細胞膜染色。它們的熒光顏色區(qū)分明顯：DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR （深紅色熒光）這使得他們可以用來對活細胞進行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分別用標準的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長的激發(fā)波長和發(fā)射波長，在細胞和組織染色中更有價值。 DiR的紅外熒光可以穿透細胞和組織，在活體成像中用來示蹤。

1. DiD，DiO，DiI，DiR和DiS細胞膜染色液制備

（1）配置DMSO或EtOH 儲存液：儲存液用 DMSO或EtOH配置濃度1～5 mM。

注意：未使用的儲存液保存在-20°C，避免反復(fù)凍融。

（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲存液，配制濃度為1～5 μM的工作液。

注意：工作液的終濃度是根據(jù)不同細胞和實驗的經(jīng)驗來配制。可以從推薦濃度的十倍以上尋找佳條件。?

2. 懸浮細胞染色

（1）懸浮細胞密度為 1 × 106/mL加入到工作液中。

（2）在37 ℃培養(yǎng)細胞 2～20分鐘，不同的細胞佳培養(yǎng)時間不同。

（3）染色細胞試管在1000～1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。

（4）傾倒上清液，再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。

（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。

3. 粘壁細胞的染色

（1）使粘壁的細胞在無菌實驗室培養(yǎng)。

（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。

（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。

（4）在37 ℃培養(yǎng)細胞 2～20分鐘，不同的細胞佳培養(yǎng)時間不同。

（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4. 顯微鏡檢測

選擇合適的DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器。

5. 流式細胞儀的檢測

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的細胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細胞儀檢測。