PART 01
提取的蛋白好進行濃度測定！！！方便進一步確定后續實驗中蛋白的上樣量。正常提取蛋白濃度時細胞樣本為2-8ug/uL，組織樣本蛋白濃度通常較高，一般是5-20ug/uL。不同濃度的蛋白樣品的在穩定性上也有一定的差異，通常情況下蛋白濃度越高穩定性越好，對于一些低濃度的蛋白樣品，可以針對性的選擇更加穩妥的保存方式。此外，一些實驗對蛋白濃度有著相對嚴格的要求，如果測得蛋白濃度不符合實驗要求則可以直接放棄重新提取或采用別的方式進行濃縮處理之后再進行實驗，提前測好濃度可以避免造成不必要的損失。
PART 02
蛋白濃度測定常用的方法有：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法、考馬氏亮藍染色法、銀染法、熒光法等方法。雙縮脲法由于檢測靈敏度不夠高，早已被 BCA 或 Bradford 法所代替。
紫外分光光度計法是利用氨基酸在 280 nm 處有吸收峰來定量，由于不同氨基酸吸收峰值略有不同，故在蛋白質成分單一的情況下使用佳，比如蛋白純化后估測蛋白的濃度。此法的缺點是測定蛋白質含量的準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。
WB實驗中常用的方法是BCA法和Bradford法。
BCA法是實驗室常用的蛋白濃度測定方法，可使用普美的增強型BCA蛋白定量試劑盒（PMK0442）本方法操作更簡單，試劑穩定，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/mL），應用更加靈活。該方法的原理是蛋白質分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結合生成深紫色的化合物，這種穩定的化合物在562nm處具有強吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。需要注意的是此方法受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，二硫蘇糖醇低于1mM，β-巰基乙醇低于0.01%
Bradford法，即考馬氏亮藍染色法，可使用普美的Bradford蛋白定量試劑盒（PMK0443）操作簡單，靈敏度高，檢測速度極快。可檢測濃度下限達25μg/mL的蛋白樣品，小檢測蛋白量達到0.5μg。Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物物質的影響。樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達5mM。但受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應的時間和溫度，建議每次測定都需要做標準曲線。
2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產生較大誤差。
3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制好選用相同的緩沖液，保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。
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