作者開發了一種空間可編程的人工金屬酶（ArMs）系統，可將鈀（Pd）催化的生物正交反應精準定位于細胞膜或細胞質。該系統由生物素化鈀輔因子、鏈霉親和素（SAV）支架和生物素化脂質錨定劑組成，利用脂質錨定或脂質體遞送實現定位控制。優化后的Pd輔因子可在高硫醇環境中高效催化Alloc脫保護，SAV突變體（S112A/K121R）使活性提升3.5倍。實驗表明，該系統可同時在膜和胞質進行雙位點催化，并通過脂質體遞送實現腫瘤靶向和前藥激活，顯著增強抗癌效果。

生物正交化學可在不干擾生命系統的前提下實現選擇性化學轉化，其中鈀（Pd）催化劑因其多功能性和生物相容性成為細胞內應用的理想選擇。然而，Pd在活細胞中面臨溶解性差、潛在毒性、定位困難和細胞內硫醇失活等挑戰。受天然金屬酶啟發，人工金屬酶（ArMs）通過將金屬中心嵌入蛋白支架（如鏈霉親和素SAV）來模擬天然酶的高效與穩定性，實現非天然催化功能。盡管ArMs在體外驗證中展現出潛力，但仍存在金屬輔因子組裝難、細胞內活性維持難和靶向遞送難等瓶頸。作者構建了一個專為細胞水平設計的ArMs平臺，利用鏈霉親和素–生物素系統高效固定生物素化Pd輔因子，借助蛋白支架保護Pd中心免受細胞內抑制劑影響，從而提升催化效率，實現精準、可控的生物正交催化。

作者設計并合成了四種新型烯烴-鈀-三苯基膦配合物（Pd1a–Pd4a），系統評估其對熒光底物Alloc-RhB和 Proc-RhB的脫保護活性。結果表明，Alloc 脫保護遠優于Proc脫保護；其中 Pd1a 在含谷胱甘肽的生理條件下表現強（10 mol % Pd，2小時44.3 % 轉化）。機理研究顯示，在強親核環境（如GSH）中，反應速率由底物-鈀配合物的親核加成/氧化加成控制；而在弱親核條件下，親核試劑介導的還原消除成為限速步驟。重要的是，Pd1a在復雜細胞裂解液中仍保持高活性，顯示其優異的生物相容性和細胞內應用潛力。

作者合成了系列不同連接臂長度的生物素化鈀復合物（Pd1b–Pd4c），經生物素–鏈霉親和素（SAV）組裝得到人工金屬酶（SAV-Pd）。SAV 四聚體在高濃度谷胱甘肽中結構穩定，所得 SAV-Pd在生理培養基和細胞裂解液中均保持催化活性。篩選結果顯示 Pd1b-SAV 與 Pd1c-SAV 活性與游離輔因子相當；進一步對催化熱點殘基S112和K121實施點突變，單突變S112A使 Pd1b-SAV 活性提升 2 倍，而雙突變S112A/K121R（SAVAR）將活性提高3.5倍，終選定 Pd1b-SAVAR用于后續細胞實驗。

作者開發了一種用于人工金屬酶(ArMs)的脂質錨定系統：借鑒GPI錨定機制，將生物素化脂質錨與突變優化的SAVAR-Pd1b組裝后，快速并穩定地錨定在細胞膜上，且具有良好的生物相容性。將高靈敏度的Alloc-caged T3前藥與膜錨定ArMs共孵育，僅需2 μM SAVAR和4 μM Pd1b即可在基因開關轉染的HeLa細胞中觸發強烈螢火蟲素酶信號；缺失脂質錨定的對照組無顯著發光，證明了膜錨定對實現高效、局部生物正交催化的關鍵作用。

作者通過陽離子脂質體（DOTAP:DOPE:Chol=1:1:1）將脂質化ArMs（s/dOle-SAVAR）高效載入（sOle插入率85.7%，dOle 41.6%），形成SAVAR@Lip。該脂質體粒徑、電位及TEM均證實結構完整；共聚焦顯示其經溶酶體后逃逸至胞質，ICP-MS證實胞內Pd含量顯著提升。功能上，經sOle-SAV^AR-Pd@Lip處理的細胞加入Alloc-RhB后，胞內出現強烈熒光，而無脂質體封裝組無信號，證明脂質體遞送實現了高效的細胞內生物正交催化。

作者通過設計“On/In-Cell”雙底物系統，實現了細胞膜與胞質的同步可控催化：利用脂質體遞送的In-Cell ArMs在胞內激活透膜底物Alloc-RhB（綠色熒光產物），隨后以膜錨定的 On-Cell ArMs在胞外催化非透膜負電底物Alloc-CQ-SO??（藍色熒光產物）。共聚焦成像顯示，藍色熒光僅出現于細胞外基質，綠色熒光僅局限于胞質，唯有同時啟動兩套系統時，兩種信號方能在同一細胞內并存，從而精確驗證了分區催化的空間定位能力。

作者以阿霉素前藥Alloc-DOX（體外毒性比游離DOX低100倍以上）為模型，證實On/In-Cell ArMs體系可在體外顯著提升其細胞毒性，且聯合系統殺傷效果優于游離DOX。體內4T1荷瘤小鼠實驗表明，脂質體遞送使ArMs在腫瘤富集，僅“ArMs+Alloc-DOX”組（20或40 μmol/kg）實現顯著抑瘤，高劑量幾乎抑制腫瘤且無明顯毒性，而低劑量游離DOX已導致體重下降及肝酶升高；組織學亦顯示ArMs組腫瘤廣泛壞死而主要臟器無損，充分證明了局部前藥激活的高效性與安全性。

該研究構建了可精準定位的ArMs平臺，突破傳統ArM空間限制，實現膜/胞質雙位點催化，并通過脂質體遞送解決體內應用難題，為靶向癌癥治療和精準化學生物學提供新范式。