CCK-8是一種高靈敏度、無放射性的比色檢測法，用于測定細胞增殖或毒性實驗中活細胞數量，可替代傳統的MTT法，常應用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。實際操作中有許多細節需要注意，本期內容主要是介紹CCK-8法的原理、步驟及注意事項。
CCK-8試劑盒是基于高度水溶性的四唑鹽 WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H- 四唑單鈉鹽)而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子介體的作用下可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成水溶性橙黃色甲瓚產物（formazan），產生顏色反應。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目成正比。增強型CCK-8試劑盒檢測靈敏度高于其他四唑鹽（例如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1）。
實驗操作流程
① 96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔；留2個空白孔不加細胞，加入同體積的培養基），將板在潮濕的培養箱中預先培養24h（37°C，5% CO2）。
②在平板的每個孔中加入 10μL CCK-8溶液，注意不要將氣泡引入孔中，因為它們會干擾 OD值讀取（步驟1中加了細胞的，留2個對照組不加藥物，加入同體積的培養基）。
③在培養箱中將平板孵育 1-4h；時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定；
④使用酶標儀測量450nm 處的吸光度。
⑤如果暫時不測定OD值，可向每孔中加入10μL 0.1 MHCL溶液或者1%（W/V）SDS溶液，并遮蓋培養板避光室溫保存。在24 h內吸光度不會發生明顯變化。
細胞種板濃度：通過查看文獻確認。查看實驗所用細胞別人是否使用過，找出大致范圍。稀釋一系列濃度種板。 貼壁生長的時間一般設置貼壁24 h，這個時間一般細胞已經貼壁完全，且對安排實驗時間也方便。
加藥后的孵育時間：設置時間梯度，根據數據的穩定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇好的時間。 接種時注意細胞懸液一定要混勻，避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接種數孔即混勻一下。培養板周圍一圈孔內的培養基容易揮發，為了減少誤差，建議培養板的四邊每孔只加培養基或無菌PBS，而不作為指標檢測孔。 CCK-8試劑加入量：按照說明書加入合適的含量。若細胞體系較大，適當增加CCK-8的量。 CCK-8試劑加入后，隨著孵育時間的增加，OD值就會增大。CCK-8的佳反應時間以顯色的佳時間為準。次做實驗時，建議先做數孔摸索接種細胞的佳數量和加入CCK-8試劑后的佳孵育時間。一般情況下，白細胞較難顯色，因此需要較長的CCK-8反應時間或增加細胞數量（約105個細胞/孔）。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于懸浮細胞，在加入CCK-8孵育1~4 h后，可先從培養箱中取出，目測染色程度或用酶標儀測定決定CCK-8佳孵育時間。若顯色困難，可將培養板放回培養箱，繼續培養數小時后再測定。對于貼壁細胞，CCK-8的孵育時間一般為1~4 h，多數細胞在培養30 min左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應，培養3.5~4 h左右檢測效果佳。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。 實驗時盡量多設置復孔，取平均值。實驗時把OD值控制在1.0左右。因人為造成的數據不穩定只能通過增大樣品數，借助數據處理來彌補。另外實驗操作一定要仔細小心，盡量平行操作。 CCK-8的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。含有酚紅的培養基不影響本試劑盒做細胞活性的測定。 如何判定待測溶液是否有還原性？不含細胞的待測溶液孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1~4 h，測定在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，說明待檢測體系中存在較少的還原劑，正式檢測時即可直接加入CCK-8；如果該吸光度相對較大，說明待檢測體系中存在較多的還原劑，正式檢測時則需要除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基和10 μL CCK-8進行檢測。 如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議設定600 nm（或600 nm以上）作為參比波長，扣除參比波長的OD值即可。
