蛋白提取
常見問題解答
RIPA裂解液作為Western blotting（WB）實驗中的常規(guī)裂解試劑，因其高效的細(xì)胞/組織裂解能力被廣泛應(yīng)用于蛋白樣品制備。RIPA裂解液根據(jù)去垢劑濃度可分為強、中、弱三種配方類型。研究表明，不同強度的裂解液在特定樣本處理時可能呈現(xiàn)差異化溶解特性，例如對膜結(jié)合蛋白或核蛋白的提取效率存在顯著差異，這可能導(dǎo)致部分目標(biāo)蛋白在提取過程中丟失。因此，如何根據(jù)實驗需求選擇合適的裂解液強度成為蛋白提取的關(guān)鍵問題。
Part.01
如何選擇裂解液
選擇裂解液時需要綜合考慮樣本類型（如組織來源、細(xì)胞系特性）、目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位（如胞漿蛋白、膜蛋白或核蛋白）以及下游應(yīng)用（Western檢測、免疫共沉淀等）等多重因素進行系統(tǒng)化選擇。
對多數(shù)實驗來說RIPA（強）裂解液（產(chǎn)品貨號：PMK0213）完全可以滿足正常的實驗需求，如果提取過程中發(fā)現(xiàn)有明顯的蛋白沉淀，可用合適的方法促進蛋白溶解，防止蛋白丟失。或采用專用的組織裂解液提取蛋白，例如提取腦組織蛋白時，可選用專用的腦組織裂解液。
Part.02
提取的時候是否需要加蛋白酶抑制劑？
蛋白酶抑制劑是維持樣本完整性的關(guān)鍵組分，防止蛋白在提取及后續(xù)保存過程中發(fā)生降解。目前很多商家都在裂解液中添加蛋白抑制劑，可以即開即用。蛋白酶抑制劑的選擇主要取決于目標(biāo)蛋白可能會被降解的酶的種類，常用的抑制劑是PMSF，可抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和乙酰膽堿酯酶。在實驗過程中還會加入蛋白酶抑制劑，如果目標(biāo)蛋白是磷酸化的蛋白，還需要額外再加磷酸化蛋白酶抑制劑。
蛋白酶抑制劑（100X）需要以1%體積比添加入裂解液中，即1mL裂解液需要加入10uL蛋白酶抑制劑（具體參照相應(yīng)產(chǎn)品的使用說明）。由于部分抑制劑（如PMSF）在水溶液中穩(wěn)定性較低，建議現(xiàn)用現(xiàn)配：在樣本裂解前5-10分鐘內(nèi)完成抑制劑與裂解液的混合配制，以確保佳保護效果。
Part.03
提取的時候應(yīng)該加多少裂解液？
細(xì)胞樣本：一般建議1-2X106細(xì)胞（即六孔板細(xì)胞密度70%左右）使用裂解液體積為200uL左右，如果需要的蛋白濃度較高，則可以根據(jù)裂解液效果適當(dāng)減少裂解液用量，如先加入100uL裂解液吹打裂解，如果發(fā)現(xiàn)樣本裂解不充分，如裂解物粘稠、膠凍樣或有明顯細(xì)胞團塊則少量多次補加裂解液進行吹打裂解，直至裂解物呈現(xiàn)比較好的線性流動狀態(tài)，可以在裂解充分的同時保證蛋白濃度。
組織樣本：常規(guī)組織（如心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉組織、腦組織等）建議裂解液體積使用體積與樣本量為10:1，如20mg組織樣本，使用裂解液量為200uL左右。一些特殊組織（如骨膜、筋膜、軟骨等）蛋白含量較低、質(zhì)地堅硬、裂解難度較大的樣本，一般建議裂解前盡量破碎處理組織（推薦液氮研磨成細(xì)粉），之后根據(jù)組織特性按照1:5-1:10加入裂解液進行裂解提取。
Part.04
血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等液體樣本的蛋白應(yīng)該如何提??？
液體樣本中的蛋白質(zhì)多數(shù)以可溶性蛋白的形式溶解于樣本內(nèi)，對于這一類樣本的蛋白獲取嚴(yán)格來講不叫提取，而應(yīng)該稱之為收集濃縮。常用的方法是透析、或超濾濃縮。可以根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小選擇合適透析膜或超濾濃縮管去除不需要的液體成分和蛋白，針對性的濃縮收集目標(biāo)蛋白。
對于血液含量較多的樣本建議取樣后先用PBS漂洗2-3次，去除樣本表面的血液。之后將樣本盡可能用剪刀剪碎加入紅細(xì)胞裂解液（產(chǎn)品貨號：PMK0011），多次反復(fù)裂解去除紅細(xì)胞及血色素后再按照正常提取流程進行蛋白提取。
Part.05
提取的蛋白應(yīng)該如何保存？應(yīng)該變性前低溫保存還是變性后再保存？
常用的蛋白保存溫度為-20℃或-80℃。-20℃可較好地保護蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。在這種溫度下，蛋白質(zhì)提取液可以較長時間保存，一般能保持?jǐn)?shù)月至一年左右的穩(wěn)定性。-80℃蛋白質(zhì)的降解和變性速度更慢，可以更長時間地保持蛋白質(zhì)的完整性和活性，可以長期保持?jǐn)?shù)年至十年的穩(wěn)定性。需要注意的是保存蛋白質(zhì)提取液時，應(yīng)避免頻繁的溫度波動和反復(fù)凍融，這可能會對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。
對于蛋白變性前保存還是變性后保存一般并沒有明確的要求或資料支持。兩種情況都可以凍存。一般建議變性后按使用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融。
