實驗步驟
1. 細胞凍存液配置：凍存液配置比例根據實驗習慣即可，建議一次少量配置，配置完成后，由于DMSO的存在，因此需要嚴格避光保存。
2.鏡下觀察細胞，當細胞密度滿足要求后，棄掉原有培養基，沿培養皿邊緣加入1mlPBS緩沖液進行清洗。
3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細胞，消化時間根據細胞類型決定。
4.消化到時間后，加入二倍胰酶體積的培養基終止消化，用移液器將細胞全部吹下，轉移至離心管內。
5.離心機常溫800rpm，離心5min。
6.棄上清，加入1ml配置好的凍存液，用移液器輕輕吹打10-15次混勻。
7.凍存管標記好相應信息，包括細胞名稱、代數、凍存時間、操作者姓名等，將上述混懸液全部轉移至凍存管內，擰緊凍存管管口，放入程序降溫盒內。
8.將程序降溫盒放入-80℃冰箱內，36h后可從程序降溫盒內拿出細胞放在細胞凍存架上保存。
凍存液配制比例
（1）培養基:血清:DMSO=7:2:1
適用于大多數細胞系，能夠保證細胞在凍存過程中有較高的存活率。
（2）血清:DMSO=9:1
適用范圍：適用于需要長時間保存或者具有特別珍貴性的細胞系。血清含量高，可以更好地保護細胞，并確保其在凍存后依然保持較好的生物學特性。
（3）無血清凍存液：適用于某些對血清敏感或需要避免血清成分的細胞系。配置比例：如10% DMSO+90%專用無血清培養基，或其他適合細胞生長的無血清替代品。
推薦使用普美生產的無血清細胞凍存液，適用于絕大部分的哺乳動物細胞凍存。不含常用的胎牛血清(FBS) 、不含任何動物來源)的蛋白質，能減少細胞污染風險，確保細胞安全；而且使用本無血清細胞凍存液，可直接置于-80℃長期保存，無須程序性降溫，使用非常便捷。
注意事項
1.在凍存管上標記信息時使用一支質量較好的馬克筆，保證在后期進行細胞復蘇時信息不會被水或酒精洗掉。
2.細胞凍存時應確保細胞處于對數生長期，形態正常，無污染。且細胞凍存數量要多，密度≥90%。
3.細胞凍存原則為“慢凍”，因此，細胞加入凍存管后如何保存應嚴格遵守凍存流程，避免凍存太快，產生結晶。
4.二甲基亞砜（DMSO）是一種細胞保護劑，在深低溫情況下可防止細胞內形成冰晶，減少細胞損傷，因此凍存液配置中DMSO必不可少，但可以改變血清的比例，對于一些原代細胞或較為重要的細胞，可將血清比例提高至50%-90%，保證其有較高的存活率。
5.細胞混懸液加入凍存管后，不宜在常溫放置過久，因此應先將細胞凍存盒放入冰箱，再進行后續相關實驗。
6.不要將DMSO直接加入含有細胞的培養基中，因為DMSO溶于培養基時會釋放大量熱量，可能燙傷細胞。在加入細胞前，可以將配置好的凍存液放于4℃進行預冷。DMSO在4°C時毒性會大大減弱，且滲透速度加快，有助于保護細胞。
7.使用凍存盒進行凍存時，必須將凍存盒解凍至室溫（避免溫度驟變對細胞的損傷）。如果直接將冷凍的凍存盒從低溫環境取出，并立即打開或處理，細胞會受到溫度驟變的影響。溫度的急劇上升可能導致細胞內冰晶的形成或擴大，對細胞膜和細胞器造成機械性損傷，進而影響細胞的存活率。
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